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- 劉森泉
- 你好，請教你一些問題。我現在在做ES向造血分化，用的是無基質無血清的方法，用的是鄧宏魁老師發在cell research的protocol，但是我分化2天后細胞全部漂浮起來了，之后一直養著，有點像細胞碎片，不像細胞的樣子。也檢測不到CD34和CD45，不知道什么情況。你之前是怎么做的呢？謝謝！
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- 劉森泉
- 那怎么才能知道克隆的基因在哪個細胞里表達啊？有這樣的網站嗎？這些基因一般不是都在造血干細胞里表達嗎，可是造血干很少很難拿到。還有，問下，你原來的老板鄧宏魁實驗室是不是都有這些基因啊？因為我老板跟他很熟，所以他有的話我可以叫老板問鄧教授拿。謝謝！
wwy551: 你先確定一下你想要克隆的基因在你選取的細胞里面是有表達的。拿到cDNA之后建議做巢式PCR擴增目的基因，就是分兩步做：先用一對primer擴目的基因兩端外側的區域， ...
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- 劉森泉
- 你好！請問下你以前克隆過造血相關的基因是伐，比如SCL,RUNX1,GATA1/2這些，請問你是從什么細胞的mRNA克的啊？我用K562，NB4這些白血病細胞株，試了好久都沒克出來啊？
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- 劉森泉
- 好的。我自己先試試。還是謝謝你！
wwy551: 這個其實我也沒有做過，我以前呆的Lab也并沒有標記的細胞系。找特定基因的啟動子，一般情況下是針對這個基因起始密碼子上游2000bp的區域設計primer，PCR擴增。當 ...
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- 劉森泉
- 非常巧，在論壇里收細胞特異性表達基因構建又收到你的帖子，現在我也想做Lineage Tracing，就是將基因啟動子跟GFP連起來，做穩定細胞株的建立。想請教下具體的流程是什么？包括啟動子的查找、PCR擴增，載體的選擇等等。謝謝！
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- 劉森泉
- 謝謝！可是細胞都懸浮著，很難把培養基吸出來，怎么操作比較好點？還有，顯微鏡下看上去很多死細胞，屬于正常情況嗎？
wwy551: 可以這樣做，也可以直接把每孔的培養液吸掉，用下一階段分化用的基礎培養基把克隆洗一下，再換成分化培養基。這樣做防止上一階段殘留的細胞因子對接下來的分化造 ...
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- 劉森泉
- 你好。請教下ES向造血分化的過程細節，我昨天把ES轉到低粘附性六孔板里，用的還是ES培養基，今天看了下，全部飄在培養基里。那要往造血分化的話是把細胞再移出來，自然沉淀，再用分化培養基重懸培養嗎？之后每步分化都同樣操作嗎？謝謝！
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- 劉森泉
- 已經很感激你了，非常感謝！
wwy551: 我們當時對實驗室的細胞因子庫及某些因子對應的拮抗劑做了screen，篩選出來了SB431542對終生造血的祖細胞發生有促進作用。
分化按stepwise進行，每一階段必須的因 ...
請問你有鄧實驗室的研究生的聯系方式嗎？郵箱什么的。畢業的沒畢業的都可以，我想找他們要個論文不知道行不行。
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- 劉森泉
- wwy551 : http://www.nature.com/cr/journal/v22/n1/full/cr2011138a.html 這是我之前在北大的一篇paper。我已經離開之前實驗室很久了，質粒之類的東西肯定是沒有的，抱歉 ... 你的文章我看了，做得很好，打算按照你的分步分化法來做做看。請教幾個問題： 1. 你怎么會想到采用TGFβ抑制劑來調節造血分化的呢？ 2. 分化步驟很費錢啊，Matrigel包被的孔板好貴，還有，第一步分化你用的是BMP4和ACTIVIN A，在之前的WNT3A的blood方法比起來怎么樣？你試過之前的分化方法嗎，感覺哪個好點？ 3. 這個SB431542有效果后有再進一步做其 ... ...
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- 劉森泉
- 已經很感激你了，非常感謝！
wwy551: http://www.nature.com/cr/journal/v22/n1/full/cr2011138a.html
這是我之前在北大的一篇paper。我已經離開之前實驗室很久了，質粒之類的東西肯定是沒有的，抱歉 ...
請問你有鄧實驗室的研究生的聯系方式嗎？郵箱什么的。畢業的沒畢業的都可以，我想找他們要個論文不知道行不行。
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- 劉森泉
- 那你以前在鄧實驗室發的文章能給我參考下嗎？還有，你們構建的質粒（RUNX1，SCL, HOXB4等等）你有嗎？非常感謝！
wwy551: 不好意思，鄧博實驗室的畢業生每個人都會留下打印裝訂好的畢業論文，但是我現在手頭上還真沒有電子版的畢業論文。
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- 劉森泉
- wwy551 : 你好！我之前在北大生科院鄧宏魁的實驗室工作了三年，今年才去港大醫學院讀PhD，所以畢業論文就沒有啦~~你可以搜一下他們實驗室做造血的paper，三篇blood和一篇c ... 原來是鄧老師的學生啊，他好像今年要去同濟了。我是浙江大學醫學院的學生，老板是黃河，浙一醫院的醫生和浙大醫學院書記，在基礎方面（多能干）剛剛起步，你可能沒聽說過。我正好想按照鄧老師之前發的文章做ES向造血分化呢，那以后有細節不懂的就請教你咯。他實驗室發了一個BMP4，RA，Lycat三篇Blood，其中Lycat是按照他在國外做斑馬魚那篇文章做的小鼠模型， ... ...
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- 劉森泉
- 你好，怕公開聯系不方便，就私下聯系你了，見諒。我實驗剛開始，很多細節不是很清楚，你正好做過這方面的，非常難得。有個奢求，你能把之前實驗室做造血分化的畢業論文給我學習學習嗎？謝謝！
