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- 刘森泉
- 你好，请教你一些问题。我现在在做ES向造血分化，用的是无基质无血清的方法，用的是邓宏魁老师发在cell research的protocol，但是我分化2天后细胞全?#31185;?#28014;起来了，之后一直养着，有点像细胞碎片，不像细胞的样子。也检测不到CD34和CD45，不知道什么情况。你之前是怎么做的呢？谢谢！
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- 刘森泉
- 那怎么才能知道克隆的基因在哪个细胞里表达啊？有这样的网站吗?#31354;?#20123;基因一般不是都在造血干细胞里表达吗，可是造血干很少很难拿到。还有，问下，你原来的老板邓宏魁实验室是不是?#21152;?#36825;些基因啊？因为我老板跟他很熟，所以他有的话我可以叫老板问邓教授拿。谢谢！
wwy551: 你先确定一下你想要克隆的基因在你选取的细胞里面是有表达的。拿到cDNA之后建议做巢式PCR扩增目的基因，就是分两步做：先用一对primer扩目的基因两?#36865;?#20391;的区域， ...
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- 刘森泉
- 你好！请问下你以前克隆过造血相关的基因是伐，比如SCL,RUNX1,GATA1/2这些，请问你是从什么细胞的mRNA克的啊？我用K562，NB4这些白血病细胞株，试了好久都没克出来啊？
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- 刘森泉
- 好的。我自己先试试。还是谢谢你！
wwy551: 这个其实我也没有做过，我以前呆的Lab也并没有标记的细胞系。找特定基因的启动子，一般情况下是针对这个基因起始密码子上游2000bp的区域设计primer，PCR扩增。当 ...
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- 刘森泉
- 非常巧，在论坛里收细胞特异性表达基因构建?#36136;?#21040;你的帖子，现在我也想做Lineage Tracing，就是将基因启动子跟GFP连起来，做稳定细胞株的建立。想请教下具体的流程是什么？包括启动子的查找、PCR扩增，载体的选择等等。谢谢！
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- 刘森泉
- 谢谢！可是细胞都悬浮着，很?#23547;?#22521;养基吸出来，怎么操作比较好点？还有，显微镜下看?#20808;?#24456;多死细胞，属于正常情况吗？
wwy551: 可以这样做，也可以直接把每孔的培养?#20309;?#25481;，用下一阶段分化用的基础培养基把克隆洗一下，再换成分化培养基。这样做防止上一阶段残留的细胞因子对接下来的分化造 ...
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- 刘森泉
- 你好。请教下ES向造血分化的过程细节，我昨天把ES转到低粘?#21483;?#20845;孔板里，用的还是ES培养基，今天看了下，全?#31185;?#22312;培养基里。那要往造血分化的话是把细胞再移出来，自然沉淀，再用分化培养基重悬培养吗？之后每步分化都同样操作吗？谢谢！
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- 刘森泉
- 已经很感激你了，非常?#34892;唬?br /> 请问你有邓实验室的研?#21487;?#30340;联系方式吗？邮箱什么的。毕业的没毕业的都可以，我想找他们要个论文不知道行不行。
wwy551: 我们当时对实验室的细胞因子库及某些因子对应的拮抗剂做了screen，筛选出来了SB431542对终生造血的祖细胞发生有促进作用。
分化按stepwise进行，每一阶段必须的因 ...
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- 刘森泉
- wwy551 : http://www.nature.com/cr/journal/v22/n1/full/cr2011138a.html 这是我之前在北大的一篇paper。我已经离开之前实验室很久了，质粒之类的东西肯定是没有的，抱歉 ... 你的文章我看了，做得很好，打算按照你的分步分化法来做做看。请教几个问题： 1. 你怎么会想到采用TGFβ抑制剂来调节造血分化的呢？ 2. 分化步骤很费钱啊，Matrigel包被的孔板好贵，还有，第一步分化你用的是BMP4和ACTIVIN A，在之前的WNT3A的blood方法比起来怎么样？你试过之前的分化方法吗，感觉哪个好点？ 3. 这个SB431542?#34892;?#26524;后有再进一步做其 ... ...
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- 刘森泉
- 已经很感激你了，非常?#34892;唬?br /> 请问你有邓实验室的研?#21487;?#30340;联系方式吗？邮箱什么的。毕业的没毕业的都可以，我想找他们要个论文不知道行不行。
wwy551: http://www.nature.com/cr/journal/v22/n1/full/cr2011138a.html
这是我之前在北大的一篇paper。我已经离开之前实验室很久了，质粒之类的东西肯定是没有的，抱歉 ...
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- 刘森泉
- 那你以前在邓实验室发的文章能给我参考下吗？还有，你们构建的质粒（RUNX1，SCL, HOXB4等等）你有吗？非常?#34892;唬?/dd>
wwy551: 不好意思，邓博实验室的毕业生每个人都会留下打印装订好的毕业论文，但是我现在手头上还真没有电子版的毕业论文。
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- 刘森泉
- wwy551 : 你好！我之前在北大生科院邓宏魁的实验室工作了三年，今年才去港大医学院读PhD，所以毕业论文就没有啦~~你可以搜一下他们实验室做造血的paper，三篇blood和一篇c ... 原来是邓老师的学生啊，他好像今年要去同济了。我是浙江大学医学院的学生，老板是黄河，浙一医院的医生和浙大医学院书记，在基础方面（多能干）刚刚起步，你可能没听说过。我正好想按照邓老师之前发的文章做ES向造血分化呢，那以后有细节不懂的就请教你咯。他实验室发了一个BMP4，RA，Lycat三篇Blood，其中Lycat是按照他在国外做斑马鱼那篇文章做的小鼠模型， ... ...
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- 刘森泉
- 你好，怕公开联系不方便，就私下联?#30340;?#20102;，见?#38534;?#25105;实验刚开始，很多细节不是很清楚，你正好做过这方面的，非常难得。有个奢求，你能把之前实验室做造血分化的毕业论文给?#24050;?#20064;学习吗？谢谢！
